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賽默飛Veriti96梯度PCR儀做實驗時的影響因素有?

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   賽默飛Veriti96梯度PCR儀做實驗時的影響因素有?
  賽默飛Veriti96梯度PCR儀采用了成熟的帕爾貼技術準確控制升降溫度,多重溫度探針檢測系統,確保每臺儀器穩定可靠運行。每一個加熱孔都經過準確計算,升溫更快,溫控更準確,保證實驗穩定進行。
  本產品能夠滿足實驗室的需求和研究者的實驗要求,出色地完成普通PCR、梯度PCR、長片段擴增、恒溫酶切和連接等實驗等試驗;同時它還采用簡單的操作面板,很好的精度和穩定性保障結果再現,升降溫速率快,Z高可達3度/秒,12步梯度選擇。
  使用賽默飛Veriti96梯度PCR儀做實驗時有哪些影響因素?
  1、酶及其濃度
  目前有兩種TaqDNA聚合酶供應,一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產物量減少。
  2、dNTP的質量與濃度
  dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度后,以1MNaOH或1MTris.HCL的緩沖液將其PH調節到7.0~7.5,小量分裝,-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中,dNTP應為50~200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度降低。
  3、溫度與時間的設置
  基于賽默飛Veriti96梯度PCR儀原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90~95℃變性,再迅速冷卻至40~60℃,引物退火并結合到靶序列上,然后快速升溫至70~75℃,在TaqDNA聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100~300bp時)可采用二溫度點法,除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性)。

TEL:18016231680

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